Іншим недоліком є те, що він не може ампліфікувати шаблони ДНК, розмір яких перевищує 2 кб. Етап нагрівання дуже важливий у гарячій ПЛР, і матрична ДНК може бути пошкоджена або серйозно зруйнована через високу температуру протягом тривалого часу.
Обмеження. Поряд із своїми перевагами ПЛР з гарячим стартом також має обмеження, які необхідно враховувати перед впровадженням методу. ПЛР з гарячим стартом вимагає додавання тепла протягом більш тривалого періоду часу на відміну від звичайної ПЛР, отже, матрична ДНК більш чутлива до пошкодження.
Недоліки ПЛР Його специфічність потенційно нижча, ніж культивування та фарбування, що означає підвищений ризик хибнопозитивних результатів. Оскільки для ідентифікації різних мікроорганізмів використовуються специфічні праймери, лікарям часто потрібно скласти список потенційних мікроорганізмів перед проведенням селективної ПЛР [17].
ПЛР з гарячим стартом є більш чутливою технікою, ніж стандартна ПЛР що дозволяє ампліфікувати мішені з низьким вмістом і однокопійні гени, одночасно зменшуючи фонові проблеми ПЛР.
Денатурація є першим етапом реакції ПЛР. Термоциклер нагрівається до приблизно 95 градусів Цельсія, що спричиняє розплавлення дволанцюгової спіралі ДНК у дві одноланцюгові матриці ДНК. Одночасно тепло на цьому етапі також активує ДНК-полімеразу – отже, гарячий старт.
ПЛР з гарячим стартом дозволяє проводити реакцію при кімнатній температурі без неспецифічної ампліфікації та утворення димеру праймера. Тоді як звичайна ПЛР часто використовується для створення експоненціальних копій вашої цільової послідовності ДНК без додаткового термочутливого компонента активації реакції.