Вестерн-блот використовує два різних типи агарозного гелю: укладання та розділення гелю. Гель з вищою концентрацією має слабку кислотність (рН 6,8) і має нижчу концентрацію акриламіду, що робить гель пористим, який погано розділяє білки, але дозволяє їм утворювати тонкі, чітко окреслені смуги.
Вестерн-блот складається з електрофорезу в поліакриламідному гелі (PAGE), з подальшим електрофоретичним перенесенням на мембрану (здебільшого PVDF або нітроцелюлоза) і процедурою імунного фарбування для візуалізації певного білка на мембрані блоту.
Огляд. SDS-PAGE зазвичай використовується для вестерн-блоттингу, де білки денатуруються та відновлюються для отримання первинної структури. Покриття молекулами SDS (додецилсульфат натрію) надає відносний негативний заряд, пропорційний їхній молекулярній масі, дозволяючи розділяти білок лише за розміром.
Необхідні матеріали:
- Промивний буфер (1X TTBS): 14 мМ NaCl, 2 мМ TRIS, 0,1% (мас./об.) Tween 20, pH 7,6.
- Блокуючий буфер: 5% (w/v) знежиреного сухого молока (NFDM) або 3% (w/v) бичачого сироваткового альбуміну (BSA) в 1X TTBS.
- Інкубаційний буфер: 1% (w/v) NFDM або 1% (w/v) BSA в 1X TTBS.
- Первинні антитіла.
Загалом, чим більший білок, тим повільніше він мігрує через гель. Акриламідні гелі можна приготувати в різних концентраціях. Як правило, білки з низькою молекулярною масою найкраще розділяються на гелях з високим відсотком, тоді як великі білки вимагають гелів з меншим відсотком для достатнього розділення.
Для вестерн-блоту потрібен зразок білка, поліакриламідний гель, мембрана для перенесення з нітроцелюлози або PVDF, буфер для перенесення та блокування, первинне та вторинне антитіло, реагенти для виявлення, такі як субстрат ECL, і обладнання для гель-електрофорезу та перенесення через мембрану.